Faleminderit që vizituat Nature.com.Ju jeni duke përdorur një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim sajtin pa stile dhe JavaScript.
Shfaq një karusel me tre rrëshqitje njëherësh.Përdorni butonat Previous dhe Next për të lëvizur nëpër tre rrëshqitje në të njëjtën kohë, ose përdorni butonat rrëshqitës në fund për të lëvizur nëpër tre rrëshqitje në të njëjtën kohë.
U zhvillua një spektrometër me nëntë ngjyra ultra-kompakt (54 × 58 × 8,5 mm) dhe me hapje të gjerë (1 × 7 mm), "i ndarë në dysh" nga një grup prej dhjetë pasqyrash dykroike, të cilat u përdorën për imazhe spektrale të menjëhershme.Fluksi i dritës rënëse me një seksion kryq më të vogël se madhësia e hapjes ndahet në një shirit të vazhdueshëm 20 nm të gjerë dhe nëntë flukse ngjyrash me gjatësi vale qendrore prej 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 dhe 690 nm.Imazhet e nëntë rrymave ngjyrash maten njëkohësisht në mënyrë efikase nga sensori i imazhit.Ndryshe nga grupet konvencionale të pasqyrave dikroike, grupi i zhvilluar i pasqyrave dikroike ka një konfigurim unik me dy pjesë, i cili jo vetëm që rrit numrin e ngjyrave që mund të maten njëkohësisht, por gjithashtu përmirëson rezolucionin e imazhit për çdo rrymë ngjyrash.Spektometri i zhvilluar me nëntë ngjyra përdoret për elektroforezë me katër kapilarë.Analizë sasiore e njëkohshme e tetë ngjyrave që migrojnë njëkohësisht në çdo kapilar duke përdorur fluoreshencën me nëntë ngjyra të induktuar nga lazeri.Meqenëse spektrometri me nëntë ngjyra nuk është vetëm ultra i vogël dhe i lirë, por gjithashtu ka fluks të lartë ndriçues dhe rezolucion të mjaftueshëm spektral për shumicën e aplikacioneve të imazhit spektral, ai mund të përdoret gjerësisht në fusha të ndryshme.
Imazhet hiperspektrale dhe multispektrale janë bërë pjesë e rëndësishme e astronomisë2, sensori në distancë për vëzhgimin e tokës3,4, kontrolli i cilësisë së ushqimit dhe ujit5,6, ruajtjes së artit dhe arkeologjisë7, mjekësisë ligjore8, kirurgjisë9, analizave biomjekësore dhe diagnostikimit10,11 etj. Fusha 1 Një teknologji e domosdoshme ,12,13.Metodat për matjen e spektrit të dritës së emetuar nga çdo pikë emetimi në fushën e shikimit ndahen në (1) skanim në pikë ("fshesë")14,15, (2) skanim linear ("panikull")16,17,18 , (3) gjatësia skanon valët19,20,21 dhe (4) imazhet22,23,24,25.Në rastin e të gjitha këtyre metodave, rezolucioni hapësinor, rezolucioni spektral dhe rezolucioni kohor kanë një marrëdhënie shkëmbimi9,10,12,26.Përveç kësaj, prodhimi i dritës ka një ndikim të rëndësishëm në ndjeshmërinë, dmth në raportin sinjal-zhurmë në imazhet spektrale26.Fluksi i ndritshëm, domethënë efikasiteti i përdorimit të dritës, është drejtpërdrejt proporcional me raportin e sasisë aktuale të matur të dritës të secilës pikë ndriçuese për njësi të kohës me sasinë totale të dritës në diapazonin e gjatësisë së valës së matur.Kategoria (4) është një metodë e përshtatshme kur intensiteti ose spektri i dritës së emetuar nga çdo pikë emetuese ndryshon me kalimin e kohës ose kur pozicioni i secilës pikë emetuese ndryshon me kalimin e kohës, sepse spektri i dritës që emetohet nga të gjitha pikat emetuese matet njëkohësisht.24.
Shumica e metodave të mësipërme kombinohen me spektrometra të mëdhenj, kompleksë dhe/ose të shtrenjtë duke përdorur 18 grila ose 14, 16, 22, 23 prizma për klasat (1), (2) dhe (4) ose 20, 21 disqe filtri, filtra të lëngshëm. .Filtra të sintonizueshëm kristalor (LCTF)25 ose filtra të sintonizueshëm akusto-optik (AOTF)19 të kategorisë (3).Në të kundërt, spektrometritë me shumë pasqyra të kategorisë (4) janë të vegjël dhe të lirë për shkak të konfigurimit të tyre të thjeshtë27,28,29,30.Përveç kësaj, ato kanë një fluks të lartë ndriçues sepse drita e ndarë nga çdo pasqyrë dikroike (d.m.th., drita e transmetuar dhe e reflektuar e dritës rënëse në secilën pasqyrë dikroike) përdoret plotësisht dhe vazhdimisht.Megjithatë, numri i brezave të gjatësisë valore (dmth. ngjyrave) që duhet të maten njëkohësisht është i kufizuar në rreth katër.
Imazhe spektrale e bazuar në zbulimin e fluoreshencës përdoret zakonisht për analiza multiplekse në zbulimin dhe diagnostikimin biomjekësor 10, 13 .Në multipleksim, meqenëse shumë analite (p.sh., ADN ose proteina specifike) janë etiketuar me ngjyra të ndryshme fluoreshente, çdo analit i pranishëm në çdo pikë emetimi në fushën e shikimit matet duke përdorur analizën shumëkomponente.32 zbërthen spektrin e zbuluar të fluoreshencës të emetuar nga çdo pikë emetimi.Gjatë këtij procesi, ngjyra të ndryshme, secila duke lëshuar një fluoreshencë të ndryshme, mund të kolokalizohen, domethënë të bashkëjetojnë në hapësirë dhe kohë.Aktualisht, numri maksimal i ngjyrave që mund të ngacmohen nga një rreze e vetme lazer është tetë33.Ky kufi i sipërm nuk përcaktohet nga rezolucioni spektral (d.m.th., numri i ngjyrave), por nga gjerësia e spektrit të fluoreshencës (≥50 nm) dhe sasia e zhvendosjes së ngjyrës Stokes (≤200 nm) në FRET (duke përdorur FRET)10 .Megjithatë, numri i ngjyrave duhet të jetë më i madh ose i barabartë me numrin e ngjyrave për të eliminuar mbivendosjen spektrale të ngjyrave të përziera31,32.Prandaj, është e nevojshme të rritet numri i ngjyrave të matura njëkohësisht në tetë ose më shumë.
Kohët e fundit, është zhvilluar një spektrometër heptakroik ultra-kompakt (duke përdorur një grup pasqyrash heptikroike dhe një sensor imazhi për të matur katër flukse fluoreshente).Spektrometri është dy deri në tre renditje të madhësisë më i vogël se spektrometrit konvencional që përdorin grila ose prizma34,35.Megjithatë, është e vështirë të vendosësh më shumë se shtatë pasqyra dykroike në një spektrometër dhe njëkohësisht të matësh më shumë se shtatë ngjyra36,37.Me një rritje të numrit të pasqyrave dikroike, ndryshimi maksimal në gjatësitë e shtigjeve optike të flukseve të dritës dikroike rritet, dhe bëhet e vështirë të shfaqen të gjitha flukset e dritës në një plan ndijor.Gjatësia më e gjatë e rrugës optike e fluksit të dritës gjithashtu rritet, kështu që gjerësia e hapjes së spektrometrit (dmth. gjerësia maksimale e dritës e analizuar nga spektrometri) zvogëlohet.
Në përgjigje të problemeve të mësipërme, u zhvillua një spektrometër ultra-kompakt me nëntë ngjyra me një grup pasqyre dekakromatike "dikroike" me dy shtresa dhe një sensor imazhi për imazhe spektrale të menjëhershme [kategoria (4)].Krahasuar me spektrometrit e mëparshëm, spektrometri i zhvilluar ka një ndryshim më të vogël në gjatësinë maksimale të shtegut optik dhe një gjatësi maksimale optike më të vogël.Është aplikuar në elektroforezën me katër kapilarë për të zbuluar fluoreshencën me nëntë ngjyra të induktuar nga lazeri dhe për të përcaktuar sasinë e migrimit të njëkohshëm të tetë ngjyrave në çdo kapilar.Meqenëse spektrometri i zhvilluar nuk është vetëm ultra i vogël dhe i lirë, por gjithashtu ka një fluks të lartë ndriçues dhe rezolucion të mjaftueshëm spektral për shumicën e aplikacioneve të imazhit spektral, ai mund të përdoret gjerësisht në fusha të ndryshme.
Spektometri tradicional me nëntë ngjyra është paraqitur në fig.1a.Dizajni i tij ndjek atë të spektrometrit të mëparshëm ultra të vogël me shtatë ngjyra 31. Ai përbëhet nga nëntë pasqyra dykroike të rregulluara horizontalisht në një kënd prej 45° në të djathtë, dhe sensori i imazhit (S) ndodhet mbi nëntë pasqyrat dykroike.Drita që hyn nga poshtë (C0) ndahet nga një grup prej nëntë pasqyrash dykroike në nëntë rrjedha drite që shkojnë lart (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 dhe C9).Të nëntë rrymat e ngjyrave futen direkt në sensorin e imazhit dhe zbulohen njëkohësisht.Në këtë studim, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 dhe C9 janë sipas gjatësisë valore dhe përfaqësohen nga magenta, vjollcë, blu, cian, jeshile, e verdhë, portokalli, e kuqe-portokalli dhe e kuqe, respektivisht.Edhe pse këto emërtime ngjyrash përdoren në këtë dokument, siç tregohet në figurën 3, sepse ato ndryshojnë nga ngjyrat aktuale që shihen nga syri i njeriut.
Diagramet skematike të spektrometrit konvencional dhe të ri me nëntë ngjyra.(a) Spektometri konvencional me nëntë ngjyra me një grup prej nëntë pasqyrash dykroike.(b) Spektromatër i ri me nëntë ngjyra me një grup pasqyre dykroike me dy shtresa.Fluksi i dritës rënëse C0 ndahet në nëntë flukse drite me ngjyra C1-C9 dhe zbulohet nga sensori i imazhit S.
Spektometri i ri i zhvilluar me nëntë ngjyra ka një grilë pasqyre dykroike me dy shtresa dhe një sensor imazhi, siç tregohet në Fig. 1b.Në nivelin e poshtëm, pesë pasqyra dykroike janë të anuara 45° në të djathtë, të rreshtuara në të djathtë nga qendra e grupit të dekamerëve.Në nivelin e sipërm, pesë pasqyra shtesë dykroike janë të anuara 45° në të majtë dhe të vendosura nga qendra në të majtë.Pasqyra dykroike më e majtë e shtresës së poshtme dhe pasqyra dykroike më e djathtë e shtresës së sipërme mbivendosen me njëra-tjetrën.Fluksi i dritës rënëse (C0) ndahet nga poshtë në katër flukse kromatike dalëse (C1-C4) nga pesë pasqyra dykroike në të djathtë dhe pesë flukse kromatike dalëse (C5-C4) nga pesë pasqyra dykroike në të majtë C9.Ashtu si spektrometrit konvencional me nëntë ngjyra, të nëntë rrymat e ngjyrave injektohen drejtpërdrejt në sensorin e imazhit (S) dhe zbulohen njëkohësisht.Duke krahasuar figurat 1a dhe 1b, mund të shihet se në rastin e spektrometrit të ri me nëntë ngjyra, si ndryshimi maksimal ashtu edhe gjatësia më e gjatë e rrugës optike e nëntë flukseve të ngjyrave janë përgjysmuar.
Konstruksioni i detajuar i një grupi pasqyre dykroike ultra të vogël me dy shtresa 29 mm (gjerësi) × 31 mm (thellësi) × 6 mm (lartësi) është paraqitur në figurën 2. Grupi i pasqyrës dykroike dhjetore përbëhet nga pesë pasqyra dykroike në të djathtë (M1-M5) dhe pesë pasqyra dykroike në të majtë ( M6-M9 dhe një tjetër M5), secila pasqyrë dykroike është e fiksuar në kllapa e sipërme prej alumini.Të gjitha pasqyrat dykroike janë të lëkundura për të kompensuar zhvendosjen paralele për shkak të thyerjes së rrjedhës nëpër pasqyra.Nën M1, është fiksuar një filtër brez-kalimi (BP).Dimensionet M1 dhe BP janë 10mm (ana e gjatë) x 1.9mm (ana e shkurtër) x 0.5mm (trashësia).Dimensionet e pasqyrave dykroike të mbetura janë 15 mm × 1,9 mm × 0,5 mm.Lartësia e matricës midis M1 dhe M2 është 1.7 mm, ndërsa hapi i matricës së pasqyrave të tjera dykroike është 1.6 mm.Në fig.2c kombinon fluksin e dritës rënëse C0 dhe nëntë flukse drite me ngjyra C1-C9, të ndara nga një matricë e pasqyrave të shkëputura nga dhoma.
Ndërtimi i një matrice pasqyre dykroike me dy shtresa.(a) Një pamje perspektive dhe (b) një pamje tërthore e një grupi pasqyre dykroike me dy shtresa (dimensionet 29 mm x 31 mm x 6 mm).Ai përbëhet nga pesë pasqyra dykroike (M1-M5) të vendosura në shtresën e poshtme, pesë pasqyra dykroike (M6-M9 dhe një tjetër M5) të vendosura në shtresën e sipërme dhe një filtër brezkalimi (BP) që ndodhet poshtë M1.(c) Pamje tërthore në drejtim vertikal, me mbivendosje C0 dhe C1-C9.
Gjerësia e hapjes në drejtimin horizontal, e treguar nga gjerësia C0 në figurën 2, c, është 1 mm, dhe në drejtimin pingul me rrafshin e figurës 2, c, të dhënë nga dizajni i kllapës së aluminit, – 7 mm.Kjo do të thotë, spektrometri i ri me nëntë ngjyra ka një madhësi të madhe hapjeje prej 1 mm × 7 mm.Rruga optike e C4 është më e gjata midis C1-C9 dhe shtegu optik i C4 brenda grupit të pasqyrës dykroike, për shkak të madhësisë së mësipërme ultra të vogël (29 mm × 31 mm × 6 mm), është 12 mm.Në të njëjtën kohë, gjatësia e shtegut optik të C5 është më e shkurtra midis C1-C9, dhe gjatësia e shtegut optik të C5 është 5.7 mm.Prandaj, diferenca maksimale në gjatësinë e rrugës optike është 6.3 mm.Gjatësitë e shtegut optik të mësipërm korrigjohen për gjatësinë e rrugës optike për transmetimin optik të M1-M9 dhe BP (nga kuarci).
Vetitë spektrale të М1−М9 dhe VR janë llogaritur në mënyrë që flukset С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8 dhe С9 të jenë në intervalin e gjatësisë valore 520–540, 540–560, 560–580, 580 –600, 600–620, 620–640, 640–660, 660–680 dhe 680–700 nm, respektivisht.
Një fotografi e matricës së prodhuar të pasqyrave dekakromatike është paraqitur në Fig. 3a.M1-M9 dhe BP janë ngjitur në pjerrësinë 45 gradë dhe planin horizontal të suportit të aluminit, përkatësisht, ndërsa M1 dhe BP janë të fshehura në anën e pasme të figurës.
Prodhimi i një sërë pasqyrash dekani dhe demonstrimi i tij.(a) Një grup pasqyrash dekakromatike të fabrikuara.(b) Një imazh i ndarë me nëntë ngjyra 1 mm × 7 mm i projektuar në një fletë letre të vendosur përpara një grupi pasqyrash dekakromatike dhe me dritë të bardhë.(c) Një grup pasqyrash dekokromatike të ndriçuara me dritë të bardhë nga pas.(d) Rrjedha ndarëse me nëntë ngjyra që buron nga grupi i pasqyrës së dekanit, i vëzhguar duke vendosur një kuti akrilike të mbushur me tym përpara grupit të pasqyrës së dekanit në c dhe duke errësuar dhomën.
Spektrat e matur të transmetimit të M1-M9 C0 në një kënd incidence prej 45° dhe spektri i matur i transmetimit të BP C0 në një kënd incidence prej 0° janë paraqitur në Fig.4a.Spektrat e transmetimit të C1-C9 në lidhje me C0 janë paraqitur në Fig.4b.Këto spektra janë llogaritur nga spektrat në Fig.4a në përputhje me shtegun optik C1-C9 në Fig. 4a.1b dhe 2c.Për shembull, TS(C4) = TS (BP) × [1 − TS (M1)] × TS (M2) × TS (M3) × TS (M4) × [1 − TS (M5)], TS (C9 ) = TS (BP) × TS (M1) × [1 − TS (M6)] × TS (M7) × TS (M8) × TS (M9) × [1 − TS (M5)], ku TS (X) dhe [ 1 − TS(X)] janë spektrat e transmetimit dhe reflektimit të X, përkatësisht.Siç tregohet në figurën 4b, gjerësia e brezit (gjerësia e brezit ≥50%) e C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 dhe C9 janë 521-540, 541-562, 563-580, 581-602, 603 -623, 624-641, 642-657, 659-680 dhe 682-699 nm.Këto rezultate janë në përputhje me diapazonin e zhvilluar.Për më tepër, efikasiteti i përdorimit të dritës C0 është i lartë, domethënë, transmetimi mesatar maksimal i dritës C1-C9 është 92%.
Spektrat e transmetimit të një pasqyre dykroike dhe një fluksi të ndarë me nëntë ngjyra.(a) Spektrat e transmetimit të matur të M1-M9 me incidencë 45° dhe PB me incidencë 0°.(b) Spektrat e transmetimit të C1-C9 në lidhje me C0 të llogaritura nga (a).
Në fig.3c, grupi i pasqyrave dykroike është i vendosur vertikalisht, në mënyrë që ana e djathtë e saj në Fig. 3a të jetë ana e sipërme dhe rrezja e bardhë e LED-it të krahasuar (C0) është e ndriçuar nga pas.Gama e pasqyrave dekakromatike e paraqitur në Figurën 3a është montuar në një përshtatës 54 mm (lartësi) × 58 mm (thellësi) × 8,5 mm (trashësi).Në fig.3d, përveç gjendjes së treguar në fig.3c, një rezervuar akrilik i mbushur me tym u vendos përpara një grupi pasqyrash dekokromatike, me dritat në dhomë të fikur.Si rezultat, nëntë rrjedha dykroike janë të dukshme në rezervuar, që burojnë nga një sërë pasqyrash dekatroike.Çdo rrjedhë e ndarë ka një seksion kryq drejtkëndor me përmasa 1 × 7 mm, që korrespondon me madhësinë e hapjes së spektrometrit të ri me nëntë ngjyra.Në figurën 3b, një fletë letre vendoset përpara grupit të pasqyrave dykroike në figurën 3c dhe një imazh 1 x 7 mm i nëntë rrymave dykroike të projektuara në letër vërehet nga drejtimi i lëvizjes së letrës.përrenj.Nëntë rrjedhat e ndarjes së ngjyrave në fig.3b dhe d janë C4, C3, C2, C1, C5, C6, C7, C8 dhe C9 nga lart poshtë, të cilat mund të shihen edhe në figurat 1 dhe 2. 1b dhe 2c.Ato vërehen në ngjyra që korrespondojnë me gjatësinë e valës së tyre.Për shkak të intensitetit të ulët të dritës së bardhë të LED-it (shih Fig. S3 plotësuese) dhe ndjeshmërisë së kamerës me ngjyra të përdorur për të kapur C9 (682–699 nm) në Fig. Rrjedhat e tjera të ndarjes janë të dobëta.Në mënyrë të ngjashme, C9 ishte pak i dukshëm me sy të lirë.Ndërkohë, C2 (rrjedha e dytë nga lart) duket e gjelbër në figurën 3, por duket më e verdhë me sy të lirë.
Kalimi nga Figura 3c në d është paraqitur në videon plotësuese 1. Menjëherë pasi drita e bardhë nga LED kalon nëpër grupin e pasqyrës dekakromatike, ajo ndahet njëkohësisht në nëntë rryma ngjyrash.Në fund, tymi në kazan u shpërnda gradualisht nga lart poshtë, kështu që edhe nëntë pluhurat me ngjyra u zhdukën nga lart poshtë.Në të kundërt, në videon Suplementare 2, kur gjatësia e valës së fluksit të dritës që bie në grupin e pasqyrave dekakromatike u ndryshua nga e gjatë në të shkurtër në rendin e 690, 671, 650, 632, 610, 589, 568, 550 dhe 532 nm. ., Shfaqen vetëm rrymat përkatëse të ndara të nëntë rrymave të ndara në rendin e C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 dhe C1.Rezervuari akrilik zëvendësohet nga një pishinë kuarci dhe thekonet e secilës rrjedhje të izoluar mund të vërehen qartë nga drejtimi i pjerrët lart.Përveç kësaj, nën-video 3 është modifikuar në mënyrë të tillë që pjesa e ndryshimit të gjatësisë valore të nën-videos 2 rishikohet.Kjo është shprehja më elokuente e karakteristikave të një grupi pasqyrash dekokromatike.
Rezultatet e mësipërme tregojnë se grupi i pasqyrave dekakromatike të prodhuar ose spektrometri i ri me nëntë ngjyra funksionon siç synohet.Spektometri i ri me nëntë ngjyra është formuar duke montuar një sërë pasqyrash dekakromatike me adaptorë direkt në tabelën e sensorit të imazhit.
Fluksi i ndritshëm me një gamë gjatësi vale nga 400 deri në 750 nm, i emetuar nga katër pika rrezatimi φ50 μm, të vendosura në intervale 1 mm në drejtim pingul me rrafshin e figurës 2c, përkatësisht Hulumtimet 31, 34. Vargu me katër thjerrëza përbëhet nga katër lente φ1 mm me një gjatësi fokale 1.4 mm dhe një hap prej 1 mm.Katër rrjedha të përafruara (katër C0) ndodhin në DP të një spektometri të ri me nëntë ngjyra, të vendosura në intervale 1 mm.Një grup pasqyrash dykroike ndan çdo rrymë (C0) në nëntë rryma ngjyrash (C1-C9).36 rrymat që rezultojnë (katër grupe C1-C9) më pas injektohen drejtpërdrejt në një sensor imazhi CMOS (S) të lidhur drejtpërdrejt me një grup pasqyrash dykroike.Si rezultat, siç tregohet në figurën 5a, për shkak të diferencës së vogël maksimale të rrugës optike dhe shtegut optik maksimal të shkurtër, imazhet e të 36 rrymave u zbuluan njëkohësisht dhe qartë me të njëjtën madhësi.Sipas spektrave të rrjedhës së poshtme (shih Figurën Suplementare S4), intensiteti i imazhit të katër grupeve C1, C2 dhe C3 është relativisht i ulët.Tridhjetë e gjashtë imazhe ishin me madhësi 0,57 ± 0,05 mm (mesatarja ± SD).Kështu, zmadhimi i imazhit ishte mesatarisht 11.4.Hapësira vertikale ndërmjet imazheve është mesatarisht 1 mm (hapësirë e njëjtë si grupi i lenteve) dhe hapësira horizontale është mesatarisht 1,6 mm (e njëjta hapësirë si një grup pasqyre dykroike).Për shkak se madhësia e imazhit është shumë më e vogël se distanca midis imazheve, çdo imazh mund të matet në mënyrë të pavarur (me ndërthurje të ulët).Ndërkohë, imazhet e njëzet e tetë rrymave të regjistruara nga spektrometri konvencional me shtatë ngjyra të përdorura në studimin tonë të mëparshëm janë paraqitur në Fig. 5 B. Vargu i shtatë pasqyrave dykroike u krijua duke hequr dy pasqyrat dykroike më të djathta nga grupi i nëntë dykroike pasqyrat në figurën 1a.Jo të gjitha imazhet janë të mprehta, madhësia e imazhit rritet nga C1 në C7.Njëzet e tetë imazhe kanë përmasa 0,70 ± 0,19 mm.Prandaj, është e vështirë të ruash një rezolucion të lartë imazhi në të gjitha imazhet.Koeficienti i variacionit (CV) për madhësinë e imazhit 28 në Figurën 5b ishte 28%, ndërsa CV për madhësinë e imazhit 36 në Figurën 5a u ul në 9%.Rezultatet e mësipërme tregojnë se spektrometri i ri me nëntë ngjyra jo vetëm që rrit numrin e ngjyrave të matura njëkohësisht nga shtatë në nëntë, por gjithashtu ka një rezolucion të lartë imazhi për secilën ngjyrë.
Krahasimi i cilësisë së imazhit të ndarë të formuar nga spektrometri konvencional dhe ai i ri.(a) Katër grupe imazhesh të ndara me nëntë ngjyra (C1-C9) të krijuara nga spektrometri i ri me nëntë ngjyra.(b) Katër grupe imazhesh të ndara me shtatë ngjyra (C1-C7) të formuara me një spektrometër të zakonshëm me shtatë ngjyra.Flukset (C0) me gjatësi vale nga 400 deri në 750 nm nga katër pika emetimi janë të lidhura dhe përplasen në secilin spektrometër, përkatësisht.
Karakteristikat spektrale të spektrometrit me nëntë ngjyra u vlerësuan eksperimentalisht dhe rezultatet e vlerësimit tregohen në figurën 6. Vini re se Figura 6a tregon të njëjtat rezultate si figura 5a, dmth në gjatësi vale 4 C0 400-750 nm, zbulohen të gjitha 36 imazhet (4 grupe C1–C9).Përkundrazi, siç tregohet në Fig. 6b–j, kur çdo C0 ka një gjatësi vale specifike prej 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 ose 690 nm, ka pothuajse vetëm katër imazhe përkatëse (katër grupet e zbuluara C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 ose C9).Megjithatë, disa nga imazhet ngjitur me katër imazhet përkatëse janë zbuluar shumë dobët sepse spektri i transmetimit C1-C9 i paraqitur në Fig. 4b mbivendoset pak dhe secila C0 ka një brez 10 nm në një gjatësi vale specifike siç përshkruhet në metodë.Këto rezultate janë në përputhje me spektrat e transmetimit C1-C9 të paraqitura në Fig.4b dhe videot suplementare 2 dhe 3. Me fjalë të tjera, spektrometri i nëntë ngjyrave funksionon siç pritej bazuar në rezultatet e treguara në fig.4b.Prandaj, arrihet në përfundimin se shpërndarja e intensitetit të imazhit C1-C9 është spektri i çdo C0.
Karakteristikat spektrale të një spektrometri me nëntë ngjyra.Spektometri i ri me nëntë ngjyra gjeneron katër grupe imazhesh të ndara me nëntë ngjyra (C1-C9) kur drita rënëse (katër C0) ka një gjatësi vale prej (a) 400-750 nm (siç tregohet në Figurën 5a), (b) 530 nm.nm, (c) 550 nm, (d) 570 nm, (e) 590 nm, (f) 610 nm, (g) 630 nm, (h) 650 nm, (i) 670 nm, (j) 690 nm, përkatësisht.
Spektometri i zhvilluar me nëntë ngjyra u përdor për elektroforezë katër-kapilare (për detaje, shih Materialet Suplementare)31,34,35.Matrica me katër kapilarë përbëhet nga katër kapilarë (diametri i jashtëm 360 μm dhe diametri i brendshëm 50 μm) të vendosura në intervale 1 mm në vendin e rrezatimit me lazer.Mostrat që përmbajnë fragmente të ADN-së të etiketuara me 8 ngjyra, përkatësisht FL-6C (ngjyrë 1), JOE-6C (ngjyrë 2), dR6G (ngjyrë 3), TMR-6C (ngjyrë 4), CXR-6C (ngjyrë 5), TOM- 6C (ngjyra 6), LIZ (ngjyra 7) dhe WEN (ngjyra 8) në rend rritës të gjatësisë valore fluoreshente, të ndara në secilin nga katër kapilarët (më poshtë referuar si Cap1, Cap2, Cap3 dhe Cap4).Fluoreshenca e induktuar nga lazeri nga Cap1-Cap4 u përshtat me një grup prej katër lentesh dhe u regjistrua njëkohësisht me një spektrometër me nëntë ngjyra.Dinamika e intensitetit të fluoreshencës me nëntë ngjyra (C1-C9) gjatë elektroforezës, domethënë një elektroforegram me nëntë ngjyra të çdo kapilar, është paraqitur në Fig. 7a.Një elektroforegram ekuivalent me nëntë ngjyra është marrë në Cap1-Cap4.Siç tregohet nga shigjetat Cap1 në Figurën 7a, tetë majat në çdo elektroforegram me nëntë ngjyra tregojnë një emetim fluoreshence nga Dye1-Dye8, respektivisht.
Kuantifikimi i njëkohshëm i tetë ngjyrave duke përdorur një spektrometër elektroforezë me katër kapilarë me nëntë ngjyra.(a) Elektroforegrama me nëntë ngjyra (C1-C9) e çdo kapilar.Tetë majat e treguara nga shigjetat Cap1 tregojnë emetimet individuale të fluoreshencës të tetë ngjyrave (Dye1-Dye8).Ngjyrat e shigjetave korrespondojnë me ngjyrat (b) dhe (c).(b) Spektrat e fluoreshencës prej tetë ngjyrash (Dye1-Dye8) për kapilar.c Elektroferograme të tetë ngjyrave (Dye1-Dye8) për kapilar.Majat e fragmenteve të ADN-së të etiketuara me Dye7 tregohen me shigjeta, dhe gjatësia e tyre e bazës Cap4 tregohet.
Shpërndarjet e intensitetit të C1-C9 në tetë maja janë paraqitur në Fig.7b, respektivisht.Për shkak se të dy C1-C9 dhe Dye1-Dye8 janë në rendin e gjatësisë valore, tetë shpërndarjet në Fig. 7b tregojnë spektrat e fluoreshencës të Dye1-Dye8 në mënyrë sekuenciale nga e majta në të djathtë.Në këtë studim, Dye1, Dye2, Dye3, Dye4, Dye5, Dye6, Dye7 dhe Dye8 shfaqen përkatësisht në ngjyrë të purpurt, vjollcë, blu, cian, jeshile, të verdhë, portokalli dhe të kuqe.Vini re se ngjyrat e shigjetave në Fig. 7a korrespondojnë me ngjyrat e bojës në Fig. 7b.Intensiteti i fluoreshencës C1-C9 për çdo spektër në figurën 7b u normalizua në mënyrë që shuma e tyre të jetë e barabartë me një.Tetë spektra fluoreshence ekuivalente u morën nga Cap1-Cap4.Mund të vërehet qartë mbivendosja spektrale e fluoreshencës midis bojës 1-ngjyra 8.
Siç tregohet në figurën 7c, për çdo kapilar, elektroforegrami me nëntë ngjyra në figurën 7a u konvertua në një elektroferogram me tetë ngjyra me anë të analizës me shumë komponentë bazuar në tetë spektrat e fluoreshencës në Figurën 7b (shih Materialet Suplementare për detaje).Meqenëse mbivendosja spektrale e fluoreshencës në Figurën 7a nuk shfaqet në Figurën 7c, Dye1-Dye8 mund të identifikohet dhe kuantifikohet individualisht në çdo moment kohor, edhe nëse sasi të ndryshme të Dye1-Dye8 fluoreshenojnë në të njëjtën kohë.Kjo nuk mund të bëhet me zbulimin tradicional me shtatë ngjyra31, por mund të arrihet me zbulimin e zhvilluar me nëntë ngjyra.Siç tregohet nga shigjetat Cap1 në figurën 7c, vetëm njësitë e emetimit fluoreshent Dye3 (blu), Dye8 (e kuqe), Dye5 (jeshile), Dye4 (cian), Dye2 (vjollcë), Dye1 (purpur) dhe Dye6 (E verdhë ) vërehen në rendin e pritur kronologjik.Për emetimin fluoreshent të ngjyrës 7 (portokalli), përveç majës së vetme të treguar nga shigjeta portokalli, u vunë re edhe disa maja të tjera të vetme.Ky rezultat është për shkak të faktit se mostrat përmbanin standarde të madhësisë, fragmente të ADN-së të etiketuara me Dye7 me gjatësi të ndryshme bazë.Siç tregohet në figurën 7c, për Cap4 këto gjatësi bazë janë 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214 dhe 220 gjatësi bazë.
Karakteristikat kryesore të spektometrit me nëntë ngjyra, të zhvilluara duke përdorur një matricë të pasqyrave dykroike me dy shtresa, janë madhësia e vogël dhe dizajni i thjeshtë.Meqenëse grupi i pasqyrave dekakromatike brenda përshtatësit të paraqitur në fig.3c i montuar direkt në tabelën e sensorit të imazhit (shih Fig. S1 dhe S2), spektrometri me nëntë ngjyra ka të njëjtat dimensione si përshtatësi, dmth 54 × 58 × 8,5 mm.(trashësia) .Kjo madhësi ultra e vogël është dy deri në tre renditje të madhësisë më e vogël se spektrometrit konvencionalë që përdorin grila ose prizma.Për më tepër, meqenëse spektrometri me nëntë ngjyra është i konfiguruar në mënyrë që drita të godasë sipërfaqen e sensorit të imazhit pingul, hapësira mund të ndahet lehtësisht për spektrometrin me nëntë ngjyra në sisteme të tilla si mikroskopët, citometrat e rrjedhës ose analizuesit.Analizator elektroforezë me grila kapilar për miniaturizimin edhe më të madh të sistemit.Në të njëjtën kohë, madhësia e dhjetë pasqyrave dykroike dhe filtrave të brezit të përdorur në spektrometrin me nëntë ngjyra është vetëm 10×1,9×0,5 mm ose 15×1,9×0,5 mm.Kështu, më shumë se 100 pasqyra të tilla të vogla dykroike dhe filtra brezkalimi, përkatësisht, mund të priten nga një pasqyrë dykroike dhe një filtër brezi 60 mm2, përkatësisht.Prandaj, një sërë pasqyrash dekakromatike mund të prodhohen me një kosto të ulët.
Një veçori tjetër e spektrometrit me nëntë ngjyra janë karakteristikat e tij të shkëlqyera spektrale.Në veçanti, ai lejon marrjen e imazheve spektrale të fotografive, domethënë, marrjen e njëkohshme të imazheve me informacion spektral.Për çdo imazh, u mor një spektër i vazhdueshëm me një gamë gjatësi vale nga 520 në 700 nm dhe një rezolucion prej 20 nm.Me fjalë të tjera, nëntë intensitete ngjyrash të dritës zbulohen për çdo imazh, dmth nëntë breza 20 nm që ndajnë në mënyrë të barabartë diapazonin e gjatësisë së valës nga 520 në 700 nm.Duke ndryshuar karakteristikat spektrale të pasqyrës dykroike dhe filtrit të brezit, mund të rregullohet diapazoni i gjatësisë së valës së nëntë brezave dhe gjerësia e secilit brez.Zbulimi i nëntë ngjyrave mund të përdoret jo vetëm për matjet e fluoreshencës me imazhe spektrale (siç përshkruhet në këtë raport), por edhe për shumë aplikacione të tjera të zakonshme duke përdorur imazhe spektrale.Megjithëse imazhet hiperspektrale mund të zbulojnë qindra ngjyra, është zbuluar se edhe me një reduktim të ndjeshëm të numrit të ngjyrave të dallueshme, objekte të shumta në fushën e shikimit mund të identifikohen me saktësi të mjaftueshme për shumë aplikacione38,39,40.Për shkak se rezolucioni hapësinor, rezolucioni spektral dhe rezolucioni i përkohshëm kanë një kompromis në imazhin spektral, zvogëlimi i numrit të ngjyrave mund të përmirësojë rezolucionin hapësinor dhe rezolucionin kohor.Mund të përdorë gjithashtu spektrometra të thjeshtë si ai i zhvilluar në këtë studim dhe të zvogëlojë më tej sasinë e llogaritjes.
Në këtë studim, tetë ngjyra u përcaktuan në sasi njëkohësisht nga ndarja spektrale e spektrave të tyre të mbivendosur të fluoreshencës bazuar në zbulimin e nëntë ngjyrave.Deri në nëntë ngjyra mund të kuantifikohen njëkohësisht, duke bashkëjetuar në kohë dhe hapësirë.Një avantazh i veçantë i spektrometrit me nëntë ngjyra është fluksi i tij i lartë i dritës dhe hapja e madhe (1 × 7 mm).Vargu i pasqyrës së dekanit ka një transmetim maksimal prej 92% të dritës nga hapja në secilën prej nëntë diapazoneve të gjatësisë valore.Efikasiteti i përdorimit të dritës rënëse në diapazonin e gjatësisë së valës nga 520 në 700 nm është pothuajse 100%.Në një gamë kaq të gjerë gjatësi vale, asnjë grilë difraksioni nuk mund të sigurojë një efikasitet kaq të lartë përdorimi.Edhe nëse efikasiteti i difraksionit të një rrjete difraksioni kalon 90% në një gjatësi vale të caktuar, ndërsa diferenca midis asaj gjatësi vale dhe një gjatësi vale të caktuar rritet, efikasiteti i difraksionit në një gjatësi vale tjetër zvogëlohet41.Gjerësia e aperturës pingul me drejtimin e planit në Fig. 2c mund të zgjatet nga 7 mm në gjerësinë e sensorit të imazhit, si në rastin e sensorit të imazhit të përdorur në këtë studim, duke modifikuar pak grupin e dekamerit.
Spektometri me nëntë ngjyra mund të përdoret jo vetëm për elektroforezë kapilar, siç tregohet në këtë studim, por edhe për qëllime të tjera të ndryshme.Për shembull, siç tregohet në figurën më poshtë, një spektrometër me nëntë ngjyra mund të aplikohet në një mikroskop fluoreshent.Rrafshi i kampionit shfaqet në sensorin e imazhit të spektrometrit me nëntë ngjyra përmes një objektivi 10x.Distanca optike midis lentës objektive dhe sensorit të imazhit është 200 mm, ndërsa distanca optike midis sipërfaqes së përplasjes së spektrometrit me nëntë ngjyra dhe sensorit të imazhit është vetëm 12 mm.Prandaj, imazhi u pre në përafërsisht madhësinë e hapjes (1 × 7 mm) në rrafshin e incidencës dhe u nda në nëntë imazhe me ngjyra.Kjo do të thotë, një imazh spektral i një fotografie me nëntë ngjyra mund të merret në një zonë 0,1×0,7 mm në planin e mostrës.Përveç kësaj, është e mundur të përftohet një imazh spektral me nëntë ngjyra të një zone më të madhe në rrafshin e mostrës duke skanuar kampionin në lidhje me objektivin në drejtimin horizontal në Fig. 2c.
Komponentët e grupit të pasqyrave dekakromatike, përkatësisht M1-M9 dhe BP, u krijuan me porosi nga Asahi Spectra Co., Ltd. duke përdorur metoda standarde të reshjeve.Materialet dielektrike me shumë shtresa u aplikuan individualisht në dhjetë pllaka kuarci me përmasa 60 × 60 mm dhe 0,5 mm të trasha, duke plotësuar kërkesat e mëposhtme: M1: IA = 45°, R ≥ 90% në 520-590 nm, Tave ≥ 90% në 610- 610 nm.700 nm, M2: IA = 45°, R ≥ 90% në 520-530 nm, Tave ≥ 90% në 550-600 nm, M3: IA = 45°, R ≥ 90% në 540-550 nm, 540-550 nm, % në 570-600 nm, M4: IA = 45°, R ≥ 90% në 560-570 nm, Tave ≥ 90% në 590-600 nm, M5: IA = 45°, R ≥ 98% në 580- nm , R ≥ 98% në 680-700 nm, M6: IA = 45°, Tave ≥ 90% në 600-610 nm, R ≥ 90% në 630-700 nm, M7: IA = 45°, R ≥ 90% 620-630 nm, Taw ≥ 90% në 650-700 nm, M8: IA = 45°, R ≥ 90% në 640-650 nm, Taw ≥ 90% në 670-700 nm, M9: R = IA ≥ 90% në 650-670 nm, Tave ≥ 90% në 690-700 nm, PB: IA = 0°, T ≤ 0,01% në 505 nm, Tave ≥ 95% në 530-650 ≥ 0 nm në -690 nm dhe T ≤ 1% në 725-750 nm, ku IA, T, Tave dhe R janë këndi i incidencës, transmetimi, transmetimi mesatar dhe reflektimi i papolarizuar i dritës.
Drita e bardhë (C0) me një gamë gjatësi vale prej 400–750 nm e emetuar nga një burim drite LED (AS 3000, AS ONE CORPORATION) u ngjit dhe u përplas vertikalisht në DP të një grupi pasqyrash dykroike.Spektri i dritës së bardhë të LED-ve është paraqitur në figurën plotësuese S3.Vendosni një rezervuar akrilik (përmasat 150 × 150 × 30 mm) drejtpërdrejt përpara grupit të pasqyrës së dekamerës, përballë PSU-së.Tymi i krijuar kur akulli i thatë zhytej në ujë u derdh më pas në një rezervuar akrilik për të vëzhguar rrjedhat e ndara me nëntë ngjyra C1-C9 që dalin nga grupi i pasqyrave dekakromatike.
Përndryshe, drita e bardhë e ngjitur (C0) kalon përmes një filtri përpara se të hyjë në DP.Fillimisht filtrat ishin filtra me densitet neutral me një densitet optik prej 0.6.Më pas përdorni një filtër të motorizuar (FW212C, FW212C, Thorlabs).Më në fund, ndizni përsëri filtrin ND.Gjerësia e brezit të nëntë filtrave të brezit korrespondon me C9, C8, C7, C6, C5, C4, C3, C2 dhe C1, përkatësisht.Një qelizë kuarci me përmasa të brendshme 40 (gjatësi optike) x 42.5 (lartësi) x 10 mm (gjerësi) u vendos përballë një grupi pasqyrash dekokromatike, përballë PB.Tymi më pas futet përmes një tubi në qelizën e kuarcit për të ruajtur përqendrimin e tymit në qelizën e kuarcit për të vizualizuar rrjedhat e ndarë me nëntë ngjyra C1-C9 që dalin nga grupi i pasqyrës dekakromatike.
Një video e rrymës së dritës së ndarë me nëntë ngjyra që buron nga një sërë pasqyrash dekanike u kap në modalitetin e kalimit të kohës në iPhone XS.Regjistroni imazhet e skenës me 1 fps dhe përpiloni imazhet për të krijuar video me 30 fps (për videon opsionale 1) ose 24 fps (për videot opsionale 2 dhe 3).
Vendosni një pllakë inox me trashësi 50 µm (me katër vrima me diametër 50 µm në intervale 1 mm) në pllakën e difuzionit.Drita me një gjatësi vale 400-750 nm rrezatohet në pllakën e difuzorit, e marrë duke kaluar dritën nga një llambë halogjene përmes një filtri të shkurtër transmetimi me një gjatësi vale ndërprerëse 700 nm.Spektri i dritës është paraqitur në figurën plotësuese S4.Përndryshe, drita kalon edhe nëpër një nga filtrat e brezit 10 nm të përqendruar në 530, 550, 570, 590, 610, 630, 650, 670 dhe 690 nm dhe godet pllakën e difuzorit.Si rezultat, katër pika rrezatimi me diametër φ50 μm dhe gjatësi vale të ndryshme u formuan në një pllakë inox përballë pllakës së difuzorit.
Një grup me katër kapilarë me katër lente është montuar në një spektrometër me nëntë ngjyra siç tregohet në figurat 1 dhe 2. C1 dhe C2.Katër kapilarët dhe katër thjerrëzat ishin të njëjta si në studimet e mëparshme31,34.Një rreze lazer me gjatësi vale 505 nm dhe fuqi 15 mW rrezatohet njëkohësisht dhe në mënyrë të barabartë nga ana në pikat e emetimit të katër kapilarëve.Fluoreshenca e emetuar nga çdo pikë emetimi klimohet nga thjerrëza përkatëse dhe ndahet në nëntë rryma ngjyrash nga një grup pasqyrash dekakromatike.36 rrymat që rezultuan u injektuan më pas drejtpërdrejt në një sensor imazhi CMOS (C11440–52U, Hamamatsu Photonics K·K.), dhe imazhet e tyre u regjistruan njëkohësisht.
ABI PRISM® BigDye® Primer për Sekuencën e Reaksionit të Gatishëm (Aplied Biosystems), 4 µl GeneScan™ 600 LIZ™ u përzie për çdo kapilar duke përzier 1 µl PowerPlex® 6C Matrix Standard (Promega Corporation), 1 µl standard i madhësisë së përzierjes.v2.0 (Thermo Fisher Scientific) dhe 14 µl ujë.Standardi i Matricës PowerPlex® 6C përbëhet nga gjashtë fragmente ADN-je të etiketuara me gjashtë ngjyra: FL-6C, JOE-6C, TMR-6C, CXR-6C, TOM-6C dhe WEN, sipas gjatësisë së valës maksimale.Gjatësitë e bazës së këtyre fragmenteve të ADN-së nuk zbulohen, por sekuenca e gjatësisë bazë të fragmenteve të ADN-së të etiketuar me WEN, CXR-6C, TMR-6C, JOE-6C, FL-6C dhe TOM-6C është e njohur.Përzierja në ABI PRISM® BigDye® Primer Cikcle Sequencing Ready Reaction Kit përmban një fragment ADN-je të etiketuar me ngjyrë dR6G.Gjatësitë e bazave të fragmenteve të ADN-së gjithashtu nuk zbulohen.GeneScan™ 600 LIZ™ Dye Size Standard v2.0 përfshin 36 fragmente të ADN-së të etiketuara me LIZ.Gjatësia e bazës së këtyre fragmenteve të ADN-së është 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 314,3 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580 dhe 600 bazë.Mostrat u denatyruan në 94°C për 3 minuta, më pas u ftohën në akull për 5 minuta.Mostrat u injektuan në secilin kapilar me 26 V/cm për 9 s dhe u ndanë në secilin kapilar të mbushur me një zgjidhje polimer POP-7™ (Thermo Fisher Scientific) me një gjatësi efektive prej 36 cm dhe një tension prej 181 V/cm dhe një kënd prej 60°.NGA.
Të gjitha të dhënat e marra ose të analizuara gjatë këtij studimi janë përfshirë në këtë artikull të botuar dhe informacionin shtesë të tij.Të dhëna të tjera të rëndësishme për këtë studim janë në dispozicion nga autorët përkatës me kërkesë të arsyeshme.
Khan, MJ, Khan, HS, Yousaf, A., Khurshid, K., dhe Abbas, A. Tendencat aktuale në analizën e imazheve hiperspektrale: një përmbledhje.Qasja në IEEE 6, 14118–14129.https://doi.org/10.1109/ACCESS.2018.2812999 (2018).
Vaughan, AH Astronomical Interferometric Spectroscopy Fabry-Pero.instaloni.Reverend Astron.astrofizikës.5, 139-167.https://doi.org/10.1146/annurev.aa.05.090167.001035 (1967).
Goetz, AFH, Wein, G., Solomon, JE and Rock, BN Spektroskopia e imazheve me sensorë të largët të Tokës.Science 228, 1147–1153.https://doi.org/10.1126/science.228.4704.1147 (1985).
Yokoya, N., Grohnfeldt, C., dhe Chanussot, J. Fusion i të dhënave hiperspektrale dhe multispektrale: një përmbledhje krahasuese e botimeve të fundit.IEEE Shkencat e Tokës.Ditari i sensorit në distancë.5:29–56.https://doi.org/10.1109/MGRS.2016.2637824 (2017).
Gowen, AA, O'Donnell, SP, Cullen, PJ, Downey, G. dhe Frias, JM Imazhe hiperspektrale është një mjet i ri analitik për kontrollin e cilësisë dhe sigurinë ushqimore.Tendencat në shkencën e ushqimit.teknologjisë.18, 590-598.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2007.06.001 (2007).
ElMasri, G., Mandour, N., Al-Rejaye, S., Belin, E. dhe Rousseau, D. Aplikimet e fundit të imazhit multispektral për monitorimin e fenotipit dhe cilësisë së farës - një përmbledhje.Sensorët 19, 1090 (2019).
Liang, H. Përparon në Imazhe Multispektrale dhe Hiperspektrale për Arkeologjinë dhe Ruajtjen e Artit.Aplikoni për një fizik 106, 309–323.https://doi.org/10.1007/s00339-011-6689-1 (2012).
Edelman GJ, Gaston E., van Leeuwen TG, Cullen PJ dhe Alders MKG Imazhe hiperspektrale për analiza pa kontakt të gjurmëve mjekoligjore.Kriminalistika.e brendshme 223, 28-39.https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2012.09.012 (2012).
Koha e postimit: Jan-10-2023